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引言

在饱和结合实验中,改变放射性配体的浓度,并测量结合度。目的是确定Kd(平衡时结合一半受体位点的配体浓度)和Bmax(最大结合位点数)。

配体不仅结合受体位点,还结合非特异性位点。处理非特异性结合有三种方法。

减去非特异性结合,且仅分析特异性结合。请继续阅读这种方法。

仅分析总结合,根据总结合曲线的形状,推断非特异性结合的量。 了解更多

同时全局分析总结合和非特异性结合。 了解更多。

循序渐进

创建一张XY数据表。将放射性配体浓度输入X,将特异性结合速度输入Y。如果您有若干个实验条件,则将第一个输入A列,第二个放入B列,依此类推。

另一种替代方法是,将总结合输入到A列,将非特异性结合输入到B列。然后,使用“删除基线”分析,从A列中减去B列,以创建包含特异性结合的新结果表。

从特异性结合表中,单击分析,选择非线性回归,选择饱和结合方程窗格,然后选择 单位点特异性结

模型

Y=Bmax*X/(Kd+X)

解读参数

Bmax为最大特异性结合,采用与Y相同的单位。这是外推到极高浓度的放射性配体的特异性结合,因此,其值几乎始终高于实验测量的任何特异性结合。

Kd是平衡解离常数,采用与X相同的单位。这是处于平衡状态时,达到一半最大结合所需的放射性配体浓度。

创建Scatchard图

在非线性回归可用之前,研究者必须将曲线数据转换成直线,进而可以使用线性回归进行分析。一种方式是使用Scatchard图,该图绘制了特异性结合与特异性结合和游离放射性配体浓度的比值。

如果您创建一个Scatcahrd图,请仅使用其来显示您的数据。进化的人视网膜和视觉皮质可检测边缘(直线),而非矩形双曲线,因此,其有助于以这种方式,显示数据。Scatchard图通常可显示为饱和结合曲线的插入图。当您想显示Bmax或Kd中的变化时,它们尤其有用。

不要使用线性回归线的斜率和截距来确定Bmax和Kd的值。如果您这样做,您将不会得到最准确的Bmax和Kd值。问题在于,转换扭曲了实验误差,因此,Scatchard图上的数据不遵从线性回归的假设。使用非线性回归获得最精确的Kd和Bmax值。

如需根据特异性结合数据来创建Scatchard图,请使用Prism“转换”分析,然后从生物化学和药理学转换窗格中,选择Scatchard转换。

如需创建对应于非线性回归拟合的Scatchard线,请执行以下步骤:

1.创建没有子列的新XY数据表。

2.在第1行中,输入X=0,Y=Bmax/Kd(先前由非线性回归确定)。您需手动计算,然后输入一个数字。

3.在第2行中,输入X=Bmax、Y=0。再次将数字输入到X列中,而非输入到文本“Bmax”中。

4.请注意该数据表的名称。或许可以将其重新命名为合适的名称。

5.转至Scatchard图。

6.将新表格从导航器中拖放到图表上。

7.双击该数据集中的一个新符号,以弹出“设置图表格式”对话框。

8.选择不绘制符号,而是用一条线连接。

 

注释

这并非确定Bmax和Kd的最佳方式。最好是 全局拟合总结合和非特异性结合,而无需减去以计算特异性结合。

绘制Scatchard图时,您必须选择您想在Y轴上使用的单位。某些研究员以cpm为单位来表示游离配体和特异性结合,因此,结合/游离比是一个无单位分数。尽管这易于解读(这是放射性配体与受体结合的分数),但另一种替代方法是,以位点/细胞或fmol/mg蛋白为单位来表示特异性结合,还以nM为单位来表示游离放射性配体浓度。尽管这使得Y轴难以直观解读,但其为斜率(其等于-1/Kd)提供了正确的单位。

该方程相当于气体吸附在表面上的Langmuir等温线。

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