除了与目标受体结合外，放射性配体还会与其他位点结合。与目标受体的结合称为特异性结合，而与其他位点的结合则称为非特异性结合。这意味着非特异性结合可能代表多种现象：

•在大多数情况下，非特异性结合的主要部分代表配体与膜之间某种形式的交互作用。其分子机制尚不明确，但非特异性结合依赖于配体的电荷和疏水性 - 而非其确切结构。

•非特异性结合也可能是与受体、转运蛋白或其他研究者不感兴趣的蛋白质的结合。例如，肾上腺素激动剂肾上腺素与血清素受体或代谢酶的结合可被视为“非特异性”结合。

•非特异性结合还可能发生在用于分离结合态与游离态配体的滤膜上。

非特异性结合通常（但并非必然）与放射性配体的浓度成正比（在其使用范围内）。若增加两倍的放射性配体，非特异性结合量也会增加一倍。

非特异性结合是通过在存在饱和浓度的、能与受体结合的未标记药物的情况下，测量放射性配体的结合来检测的。在这种条件下，几乎所有的受体都被未标记药物占据，因此放射性配体只能结合到非特异性位点上。 将特定浓度放射性配体的总结合量减去该浓度下的非特异性结合量，即可计算出放射性配体与受体的特异性结合量。

应选用哪种未标记药物来测定非特异性结合？显而易见的答案是使用与放射性配体相同的化合物，但采用其未标记形式。 在许多情况下这是必要的，因为尚无其他已知药物能与该受体结合。但大多数研究者避免将放射性配体与非放射性配体设为同一化合物，而倾向于选用一种在化学结构上与放射性配体不同、但能结合同一受体的药物来定义非特异性结合。

应使用何种浓度的未标记药物？浓度应足够阻断几乎所有的放射性配体特异性结合，但又不能过高，以免引起膜的更普遍的物理变化，从而改变结合。 若研究的是特性已知的受体，一个实用的经验法则是：将无标记化合物的浓度设定为该受体Kd值的100倍，或放射性配体最高浓度的100倍，取两者中较高的值。

理想情况下，使用多种药物在不同浓度范围内定义非特异性结合时，应得到一致的结果，且应尽可能进行此类测试。 在许多检测体系中，非特异性结合仅占放射性配体总结合量的10%至20%。如果非特异性结合占总结合量的半数以上，将难以获得高质量的数据。如果您的体系中存在大量非特异性结合，请尝试使用不同类型的滤膜、增加洗涤缓冲液的体积、提高洗涤缓冲液的温度，或更换放射性配体。