引言

解离结合实验用于测定放射性配体从受体上解离的“解离速率”。最初，让配体与受体结合，直至达到平衡状态。此时，需要阻断放射性配体与受体的进一步结合，以便测定解离速率。实现这一目的的方法有多种：

•如果组织附着在某种表面上，可以移除含有放射性配体的缓冲液，并用不含放射性配体的新鲜缓冲液替换。

•对悬浮液进行离心处理，然后用不含放射性配体的全新缓冲液重新悬浮。

•加入极高浓度的未标记配体。如果浓度足够高，它将立即与几乎所有未被占用的受体结合，从而阻断放射性配体的结合。

•将孵育液大幅稀释，稀释倍数至少为100倍。这将使放射性配体的浓度按该倍数降低。 在如此低的浓度下，放射性配体的新的结合可忽略不计。只有当您使用相当低浓度的放射性配体时，该方法才切实可行，因为稀释后的浓度远低于其结合的Kd值。

随后，在不同时间点测量结合情况，以确定放射性配体从受体上脱落的速率。

分步操作

创建一个 XY 数据表。将时间输入到 X 列，将总结合输入到 Y 列。如果有多个实验条件，将第一个放入 A 列，第二个放入 B 列，依此类推。

从特异性结合表中，单击“分析”，选择“非线性回归”，选择“动力学结合方程”面板，然后选择“解离——单相指数衰减”。

模型

Y=(Y0-NS)*exp(-K*X) + NS

参数解读

Y0 是时间零点时的结合量，单位为 Y 轴的单位。

NS 是无限时间时的结合量（非特异性），单位为 Y 轴的单位。

K 是速率常数，单位为 X 轴的倒数。半衰期等于 ln(2) 除以 K。

检查协同作用

如果质量作用定律成立，则配体与一个结合位点的结合不会改变另一个结合位点的亲和力。这也意味着，配体从一个位点解离不应改变其从其他位点解离的情况。 为了验证这一假设，需将通过无限稀释法诱导解离后的解离速率，与通过添加高浓度未标记药物诱导解离时的解离速率进行比较。如果放射性配体结合在多个互不作用的结合位点上，则如下图左侧所示，两种实验方案下的解离速率将完全一致。 请注意，Y轴采用对数刻度。如果只有单一结合位点，则预期解离数据在该图上呈线性分布。当存在两个结合位点时，即使在对数轴下，曲线也会呈现弯曲形态。

右图展示了放射性配体结合于具有负协同作用的交互作用结合位点时的理想解离数据。数据因解离的启动方式不同而有所差异。若通过无限稀释法启动解离，解离速率会随时间变化。 部分放射性配体的解离会导致剩余配体的结合更牢固。当解离由冷药物的加入引发时，所有受体始终被配体占据（部分为热配体，部分为冷配体），且解离以最大且恒定的速率进行。