引言

仅通过观察单一浓度的放射性配体与受体的结合，无法确定结合速率常数。配体达到平衡的速度不仅取决于结合速率常数和配体浓度，还取决于解离常数。

确定结合速率常数的一种方法是对使用两种不同浓度的放射性配体获得的数据进行全局拟合。本文介绍的另一种方法是在同一实验中同时测量结合和解离过程。

加入放射性配体并在多个时间点测量总结合量，随后在时间0点引发解离（通过添加拮抗剂或进行大幅稀释），然后在不同时间点测量解离情况。

分步操作

创建一个XY数据表。在X轴中输入时间（单位：分钟），在Y轴中输入总结合。

从特异性结合数据表中，点击“分析”，选择“非线性回归”，选择“动力学结合方程”面板，并选择“结合然后离解”。

将 HotNM（[放射性配体浓度，单位为 nM]）和 Time0（启动解离的时间）约束为常数值。如果您在 Y 列中输入了特异性结合量，还应将 NS 约束为常数值零。

模型

放射性配体=HotNM*1e-9

Kob=[放射性配体]*Kon+Koff

Kd=Koff/Kon

Eq=Bmax*放射性配体/(放射性配体 + Kd)

结合=Eq*(1-exp(-1*Kob*X))

YatTime0 = Eq*(1-exp(-1*Kob*Time0))

解离= YatTime0*exp(-1*Koff*(X-Time0))

Y=IF(X<Time0, 结合, 解离) + NS

 

参数解读

Koff 是解离常数，单位为 min⁻¹。

Kon 是结合常数，单位为倒数分钟乘以倒数浓度。

KD 由 Koff/Kon 计算得出。以摩尔为单位表示。

Bmax 是放射性配体浓度达到最大值时，在平衡状态下的最大结合量，单位为 Y 轴单位。除非您使用了非常高的放射性配体浓度，否则 Bmax 将具有较宽的置信区间，因为该实验并非旨在确定 Bmax。

NS 是非特异性结合，单位为 Y 轴。它既是时间 0 时的 Y 值，也是所有配体解离后的非常晚时间点的 Y 值。