引言

除非能根据其他实验将 koff 限定为一个常数值，否则无法仅凭单一放射性配体浓度下测得的结合速率来确定 kon。观测到的结合速率依赖于结合速率常数、所用配体的量及其解离速率常数。仅使用一种放射性配体浓度时，结果模糊拟合。

若进行多浓度放射性配体结合动力学实验，则可将数据整体拟合至结合动力学模型，从而分别推导出 kon 和 koff 的最佳拟合值。

下文展示了一个使用两种放射性配体浓度进行的结合动力学实验示例。当然，两次实验的所有其他条件（温度、pH值等）均保持一致。时间数据输入到X列，一种放射性配体浓度的特异性结合率输入到第一列（A）Y列，另一种浓度的结合率则输入到B列。

分步操作

创建一个 XY 数据表。在 X 列中输入以分钟为单位的时间，在 Y 列中输入总结合量。在 A 列中输入一种放射性配体浓度的结合量，在 B 列中输入另一种浓度的结合量，依此类推。在列标题中输入以 nM 为单位的浓度。

在特异性结合数据表中，点击“分析”，选择“非线性回归”，选择“动力学结合方程”面板，然后选择“结合 - 两种或多种放射性配体浓度”。

模型

Kd=Koff/Kon

L=Hotnm*1e-9

Kob=Kon*L+Koff

占位率=L/(L+Kd)

Ymax=占用率*Bmax

Y=Ymax*(1 - exp(-1*kob*X))

参数解读

Koff 是解离速率常数，单位为 min⁻¹。

Kon 是结合速率常数，单位为 M⁻¹ min⁻¹。

Kd 是平衡解离常数，单位为摩尔，计算公式为 Koff/Kon

Bmax 是平衡状态下的最大结合量，在放射性配体浓度最大时，单位与您输入 Y 时使用的单位相同。

注释

根据质量作用定律，Koff 与 Kon 的比值即为受体结合的 Kd 值：

将通过此方法（基于动力学实验）计算出的 Kd 与从饱和结合曲线确定的 Kd 进行比较。如果结合遵循质量作用定律，这两个 Kd 值应无法区分。