引言

在饱和结合实验中，通过改变放射性配体的浓度并测量结合情况，旨在确定Kd值（在平衡状态下，配体与受体位点结合达到一半时的配体浓度）和Bmax值（最大结合位点数）。

配体不仅会与受体位点结合，还会与非特异性位点结合。处理非特异性结合有三种方法。

•扣除非特异性结合，仅分析特异性结合。请继续阅读了解此方法。

•仅分析总结合量，并根据总结合曲线的形状推断非特异性结合的量。了解更多。

•同时对总结合和非特异性结合进行整体分析。了解更多。

分步操作

创建一个 XY 数据表。将放射性配体浓度输入 X 列，特异性结合量输入 Y 列。如果有多个实验条件，将第一个条件放入 A 列，第二个放入 B 列，依此类推。

另一种方法是将总结合输入到 A 列，非特异性结合输入到 B 列。然后使用“去除基线”分析将 B 列的数值从 A 列中减去，从而生成包含特异性结合量的新结果表。

在特异性结合数据表中，点击“分析”，选择“非线性回归”，选择“饱和结合方程”面板，并选择“单位点特异性结合”。

模型

Y = Bmax*X/(Kd + X)

参数解读

Bmax 是最大特异性结合量，单位与 Y 相同。它是外推至极高放射性配体浓度时的特异性结合量，因此其值几乎总是高于实验中测得的任何特异性结合量。

Kd 是平衡解离常数，单位与 X 相同。它是达到平衡时实现半最大结合所需的放射性配体浓度。

绘制斯卡查德图

在非线性回归技术出现之前，研究人员必须将曲线数据转换为直线，以便通过线性回归进行分析。实现这一目标的一种方法是绘制斯凯查德图，该图以特异性结合量为横轴，以特异性结合量与游离放射性配体浓度之比为纵轴。

若绘制斯凯查德图，请仅将其用于展示数据。人类的视网膜和视觉皮层在进化过程中适应于识别边缘（直线），而非直角双曲线，因此以这种方式展示数据会更直观。 斯凯查德图通常作为饱和结合曲线的插图呈现。当您需要展示 Bmax 或 Kd 的变化时，它特别有用。

请勿使用线性回归直线的斜率和截距来确定 Bmax 和 Kd 的数值。若采用此方法，将无法获得最精确的 Bmax 和 Kd 值。问题在于，这种转换会扭曲实验误差，因此 Scatchard 图上的数据并不符合线性回归的假设。 请使用非线性回归来获得 Kd 和 Bmax 的最准确值。

若要根据您的特异性结合数据绘制斯凯查德图，请使用 Prism 的“变换”分析功能，并从生物化学和药理学变换面板中选择“斯凯查德变换”。

要绘制与非线性回归拟合结果相对应的 Scatchard 线，请按照以下步骤操作：

1.创建一个新的 XY 数据表，不包含子列。

2.在第 1 行输入 X=0，Y=Bmax/Kd（此前已通过非线性回归确定）。您需要手动进行计算，并输入一个数值。

3.在第 2 行输入 X=Bmax 和 Y=0。同样，请在 X列中输入数值，而非文本“Bmax”。

4.记下该数据表的名称。不妨将其重命名为更恰当的名称。

5.转到 Scatchard 图。

6.从导航器中拖动新表格并将其拖放到图表上。

7.双击该数据集的一个新符号，调出“设置图表格式”对话框。

8.选择不绘制符号，而是用一条线连接。

 

注

•这并不是确定 Bmax 和 Kd 的最佳方法。最好对总结合和非特异性结合进行全局拟合，而不通过减法来计算特异性结合。

•绘制 Scatchard 图时，必须选择 Y 轴使用的单位。有些研究者将游离配体和特异性结合均以 cpm 表示，因此结合/游离的比值是一个无量纲的分数。 虽然这种表示方式易于解读（即与受体结合的放射性配体的比例），但另一种方法是将特异性结合以“结合位点/细胞”或“fmol/mg 蛋白质”表示，并将游离放射性配体浓度以 nM 表示。 虽然这会使Y轴在视觉上难以解读，但它为斜率（等于-1/Kd）提供了正确的单位。

•该方程等同于气体在表面吸附的朗缪尔等温线。