引言

在饱和结合实验中，通过改变放射性配体的浓度并测量结合情况，旨在确定Kd（在平衡状态下结合到一半受体位点的配体浓度）和Bmax（最大结合位点数）。

配体不仅会结合到受体位点，还会结合到非特异性位点。处理非特异性结合主要有三种方法。

•扣除非特异性结合，仅分析特异性结合。请继续阅读了解此方法。

•仅分析总结合量，并根据总结合曲线的形状推断非特异性结合量。了解更多。

•同时对总结合量和非特异性结合进行整体分析。了解更多。

分步操作

创建一个 XY 数据表。将放射性配体浓度输入 X 列，特异性结合量输入 Y 列。如果有多个实验条件，将第一个条件放入 A 列，第二个放入 B 列，依此类推。

另一种方法是将总结合输入到 A 列，非特异性结合输入到 B 列。然后使用“去除基线”分析从 A 列中减去 B 列，从而生成包含特异性结合量的新结果表。

在特异性结合数据表中，点击“分析”，选择“非线性回归”，选择“饱和结合方程”面板，并选择“单位点特异性结合”。

模型

Y = Bmax*X/(Kd + X)

参数解读

Bmax 是最大特异性结合量，单位与 Y 相同。它是外推到极高放射性配体浓度下的特异性结合量，因此其值几乎总是高于实验中测得的任何特异性结合量。

Kd 是平衡解离常数，单位与 X 相同。它是达到平衡时实现半最大结合所需的放射性配体浓度。

绘制 Scatchard 图

在非线性回归技术出现之前，研究者必须将曲线数据转换为直线，以便进行线性回归分析。实现这一目标的一种方法是绘制 Scatchard 图，该图以特异性结合量为横轴，以特异性结合量与游离放射性配体浓度的比值为纵轴。

若绘制 Scatchard 图，请仅将其用于展示数据。人类视网膜和视觉皮层在进化过程中适应于检测边缘（直线），而非直角双曲线，因此以这种方式展示数据会更直观。Scatchard 图通常作为饱和结合曲线的插图呈现。当需要展示 Bmax 或 Kd 的变化时，它尤为有用。

请勿使用线性回归直线的斜率和截距来确定 Bmax 和 Kd 的数值。若采用此方法，将无法获得最精确的 Bmax 和 Kd 值。问题在于这种转换会扭曲实验误差，导致 Scatchard 图上的数据不符合线性回归的假设。请使用非线性回归以获得最精确的 Kd 和 Bmax 值。

若要根据您的特异性结合数据绘制 Scatchard 图，请使用 Prism 的“转换”分析功能，并在生物化学与药理学转换面板中选择 Scatchard 转换。

要绘制与非线性回归拟合结果对应的 Scatchard 曲线，请按照以下步骤操作：

1.创建一个新的 XY 数据表，不包含子列。

2.在第 1 行输入 X=0，Y=Bmax/Kd（此前已通过非线性回归确定）。您需要手动进行计算，并输入数值。

3.在第 2 行输入 X=Bmax 和 Y=0。同样，请在 X列中输入数值，而非文本“Bmax”。

4.记下此数据表的名称。建议将其重命名为更合适的名称。

5.转到 Scatchard 图。

6.将新表格从导航器拖拽并放置到图表上。

7.双击该数据集的新符号之一，调出“设置图表格式”对话框。

8.选择不绘制符号，而是用一条线连接。

 

注释

•这并非确定 Bmax 和 Kd 的最佳方法。更好的做法是整体拟合总结合量和非特异性结合量，而不通过减法来计算特异性结合量。

•绘制 Scatchard 图时，必须选择 Y 轴使用的单位。有些研究者将游离配体和特异性结合均以 cpm 表示，因此结合/游离的比值是一个无量纲的分数。 虽然这种表示法易于解读（即放射性配体与受体结合的比率），但另一种做法是将特异性结合以“结合位点/细胞”或“飞摩尔/毫克蛋白质”表示，并将游离放射性配体浓度以纳摩尔表示。虽然这使得Y轴难以直观解读，但它为斜率（等于-1/Kd）提供了正确的单位。

•该方程等同于气体吸附于表面的朗缪尔等温线。