引言

您无需直接测量非特异性结合。相反，您可以通过拟合总结合量来确定 Bmax 和 Kd，前提是假设非特异性结合量与放射性配体的浓度成正比。

如果只有一小部分放射性配体发生结合，则可以使用简单模型。

该方程允许所加配体的相当一部分发生结合。此方法仅适用于放射性配体，因此所加配体和结合配体的评估均采用每分钟计数（cpm）单位。该方法不适用于荧光配体。

分步操作

创建一个XY数据表。将放射性配体浓度填入X列，总结合量填入Y列。若有多个实验条件，请将第一个条件置于A列，第二个置于B列，依此类推。

请将 X 和 Y 均以 CPM 单位输入。这是分析成功的关键。

在总结合表格中，点击“分析”，选择“非线性回归”，选择“饱和结合方程”面板，并选择“单结合位点 - 总结合量（考虑配体耗竭）”。

您必须根据实验设计将两个参数约束为常数：

•SpAct 为特异性放射性活度（单位：cpm/fmol）

•Vol 为反应体积（ml）

模型

KdCPM=KdnM * Vol * 1000 * SpecAct 

; (nm/L * mL * 0.001 L/ml * 1000000 fmol/nmol * cpm/fmol)

a=-1-NS

b=KdCPM + NS*KdCPM + X + 2*X*NS + Bmax

c=-1*X*(NS*KdCPM + X*NS+Bmax)

Y=(-b+√(b²-4ac))/(2a) ;Y 单位为 cpm

 

参数解读

Bmax 是最大特异性结合数，单位为 cpm。

KdnM 是平衡解离常数，单位为 nM。

NS 是非特异性结合的斜率，单位为 Y 除以 X。

注释

此分析考虑了添加的放射性配体中有很大一部分会与受体结合这一事实。如果您能够假设只有一小部分放射性配体会结合（这意味着您添加的浓度与游离浓度几乎相同），请使用替代分析。

参考文献                                                                         

该方程引自 S. Swillens（《分子药理学》，47: 1197-1203, 1995）